生物感測器

吳宗正

 


一、緒言

在科學的領域裡面,所有研究者幾乎都有一種共識─無法量測的東西,我們就無從真正去了解。此一共識將它說成準則並不為過,尤其在快速發展的生物或醫療科技領域中,特別感觸良深,因為影響進步的阻力,通常受制於量測方面的因素。

生物感測器雖然仍在發展中,雖然已有部份的成果已商品化,然絕大部分的研究成果,卻離商品化、實用化仍有一段相當遙遠的距離。生物感測器可以期望符合某些及重要量測的需求,特別在藥品、代謝與其他生物分子間交互作用的測定上。雖然有很多型式的傳統分析儀器可以達到類似的目的,但生物感測器最獨特的地方就是來自生物體的元件與其所具備的高特異性、高靈敏度或高選擇性,與即時輸出(real-time output)等特性,而且真實地結合結合元件當作感測器或探針構造的一部分部由於生物感測器的接近自然的特性,因此可以預期它的主要應用至少在下列五個領域:

  1. 醫藥及動物藥品,
  2. 生物科技,
  3. 食品與農業,
  4. 環境監測,

    5.軍事防禦用途等。

二、生物感測器的定義與其發展歷史回顧

生物體本身就具有各式各樣的化學量感受器,包括味覺、嗅覺、內分泌系統的荷爾蒙受體,神經傳導系統的神經化學傳遞物質與受體蛋白質,酵素與基質及免疫系統中的抗體─抗原等等。因此,生物體本身實際上式一個化學受體(chemoreceptors)的集合體。這些化學受體均具有高度的特異性/選擇性與靈敏度,而且絕大部分係屬於受體蛋白質分子。

生物感測器定義為使用固定化的生物分子(immobilized biomolecules)結合換能器,用來偵測生體內或生體外的環境化學物質或與之起特異性交互作用後產生回應的一種裝置

生物感測器由兩個主要關鍵部份所構成,依違來自於生物體分子、組織部份或個體細胞的分子辨認元件,此一元件為生物感測器信號接收或產生部份。另一為屬於硬體儀器元件部份,主要為物理信號轉換元件。因此,如何已生化方法分離、純化甚或設計合成特定的生物活性分子(biological active materials),結合精確而且回應快速的物理換能器(transducers)組合成生物感測器反應系統,實為研究生物感測器的主要目的。

生物感測器的發展,自1962年Clark和Lyon兩人提出酵素電極的觀念以後,YSI公司於七零年代即積極投入商品化開發與生產,啟開了第一世代生物感測器於1979年投入醫檢市場,最早的商品為血糖測試用酵素電極。YSI公司的上市成功與八零年代電子資訊業的蓬勃發展有很密切的關係,並且一舉帶動了生物感測器的研發熱潮。Medisense公司繼續以研發第一代酵素電極為主,於1988年由於成功的開發出調節(mediator)分子來加速回應時間與增強測試靈敏度而聲名大噪,並以筆型(Pen 2)及信用卡型(companion 2)之攜帶型小型生物感測器產品,於1988年上市後立即襲捲70%以上的第一代產品市場,成為生物感測器業的盟主。第二世代的生物感測器定義為使用抗體或受體蛋白當分子識別元件,換能器的選用則朝向更為多樣化,諸如場效半導體(FET),光纖(FOS),壓電晶體(PZ),表面聲波器(SAW)等。雖然第二世代的生物感測器,自八零年代中期即開始引起廣泛的研發興趣,但醫般認為尚未達醫檢應用階段,預定相關技術須待世紀末前方能成熟。目前可稱的上帝二世代的生物感測器產品為1991年上市的瑞典商Pharmacia所推出的BIAcore與BIAlite兩項產品。Pharmacia公司於1985年成功地開發出表面薄膜共振技術(SPR, Surface Plasma Resonance),利用此一光學特性開發出可以於10-6g/ml到10-11g/ml之低濃度下,進行生物分子間交互作用的即時偵測式生物感測儀器。第三世代的生物感測器定位在更具攜帶式,自動化,與即時測定功能,預測在二十一世紀初期可以達到上市目標。至於第四世代具偵測/信號輸出/控制/自我組合/自我修補與複製等功能的生物感測器將於何時出現,則尚無法預估。

三、生物感測器的類型

生物感測器微生物電子產品(bioelectronic product)。為了能夠獲得最佳的信號傳遞,固定化的生物元件通常與信號轉換元件緊密地接合在一起。基本上,由信號產生方式(mode of signal generation)的不同,可以將生物感測器區分成兩種主要類型:

 

  • (一)生物親和性感測器(Bioaffinity sensors)

當固定生物元件與待測定之分析物發生親和性結合(bioaffinity binding)時,造成生物分子形狀改變與/或引起諸如荷電、厚度、質量、熱量或光學等物理量的變化。此種經由分子辨認─結合類型的生物感測器有免疫感測器、化學受體感測器等,其分析可為荷爾蒙、蛋白質、醣類、抗原或抗體,而相對應的受體可為荷爾蒙受體、染劑、外源凝集素(lectins)、抗體或抗原等。

        (二)生物催化型感應器(Biocatalytic biosensors)

此類感測器之信號偵測並不在於分子辨認─結合的階段,兒戲當固定劃分子與待測物反應後,產生生化代謝物質,再經特定電極偵測特定代謝物後以電子訊號表現出來。最為人所熟悉的為屬第一世代生物感測器的酵素電極。目前有關此類生物感測器的兩個主要研究發展方向為(1)使用酵素共軛物(enzyme conjugates)、環系酵素群(cycling enzymes)和系列酵素來組合生物感測器,(2)使用微生物細胞或動、植物組織切片或可滲透性細胞(permealized cells)等來當作分子辨認元件。

四、生物感測器設計

構成生物感測器關鍵技術得兩個主要元件為生物辨認分子與物理換能器。在欲發展一特定功能的生物感測器前,首先必須根據選用生物分子的特性、作用機制、信號產生/輸出模式、待測物濃度範圍、操作環境等參數做通盤性的考慮,再慎選適當的信號轉換器,亦即換能器。圖依違目前較可以有效掌握的葛種感測元件及其應答濃度範圍。圖中央粗線為濃度標尺,由右至左濃度漸低。標尺上方為各種換能器元件與傳統分析方法之應答濃度範圍之相對位置。下方則為常需量測之生物有機分子、待測物及期存在於生體內外的濃度範圍。

由選用換能器的不同,生物感測器設計時可以細分成下列數項主要技術:

  • (一)電化學生物感測器(Eletrochemical Biosensor)技術

此類型的感測器發展的最早,Clark和Lyons首先開發出酵素電極生物感測器,以電流計測方式測定測定溶液中葡萄糖的濃度。大部分的生化代謝型生物感測器均使用特定的電極當作訊號轉換器,如溶氧電極、白金電極、氨電極、二氧化碳電極與pH電極等。而信號輸出的方式又可分為電流、電壓與導電度測定等方法。酵素電極的測定原理為利用特定電極量取反應產物之生成量或反應物之消失量。例如使用葡萄糖氧化酵素(glucose oxidase,GOD)固定化在氧電極尚來定量反應溶液中氧氣的濃度,當葡萄糖被GOD氧化時:

GOD

Gloucose+O2──── Gluconolactone+H2O2

溶液中氧氣遞減現象可由溶氧電極量測出,而氧氣消耗量正與葡萄糖濃度成正比例關係。

一般而言,酵素電極之測定濃度範圍約在mM到ppm之間,其回應時間在0.1到10分鐘。電極之安定性(Stability)在1到100天之間。

另外,此類型生物感測器液可使用含有活性酵素之整體細胞,如微生物、動、植物細胞切片來製成特定用途之生物感測器。

  • (二)半導體離子感測器─離子選擇性場效電晶體(ISFET, Ion Sensitive Field Effect Transistor)

此類型的半導體係由金屬絕緣場效性晶體(MISFET, Metal Insulating Field Effect Transistor)改良而成,使用不易被水分子及離子物質侵入的氮化矽(SiN4)膜取代MOSFET使用的金屬氧化物薄膜。再於氮化矽膜上共價接合一層已固定化有生體活性物質的薄膜當作離子感應膜,另以Ag/AgCl電極當作參考電極,如圖二所示。此類感測器可直接安置於溶液中,當待測物與離子感應膜上的接受器產生反應後,離子感應膜即產生界面電位變化,信號則由漏極(drain)輸出。ISFET的離子感應膜上如選用適當的離子選擇性材料,即可感應出不同離子。到目前為止已有可以感應Na+、K+、NH4+、Ca+2、Ag+、Li+、Cl-、Br-等離子的ISFET。又,假如以固定化酵素薄膜代替離子感應膜,則此種設計稱為ENFET(酵素場效性半導體)。已見諸文獻的則有盤尼西林(penicilin)感測器,尿素感測器,葡萄糖感測器,乙醯膽鹼(acetylcholine)感測器等。

ISFET的優點微:(1)超小型,可利用半導體技術做微加工,(2)可多重化,做成同時測定多種成份的陣列感測器,(3)應答快速,經由離子感應膜的超薄化,可以縮短回應時間。

  • (三)光纖生物感測器(Fiber-optic biosensor)

光纖傳輸在近代先端科技,尤其在資訊傳輸路徑,確保信號品質上扮演極重要角色。光纖利用內部全反射來導光,不易受電氣雜訊及其他外在因素影響,而且外型纖細、傳輸失真小(每公里1.5mm波長以下)。光纖應用在計測、控制系統時,必須配合可靠性很高的高性能光感測器。圖三a及b為光纖感測器的光學路徑與典型的儀器系統。光纖生物感測器的構造為在光纖的縱切端面,固定化一層適當的指示劑材料(例如生物螢光物質,化學發光物質或染料),當測定容易內發生生化反應時,由指示劑材料的變化產生光學訊號。該光學訊號可藉由儀器系統量取吸光量、螢光強度、反射強度、顏色、混濁度或冷光(luminesence)變化等參數值來達到測定目的。為達上述目的,光纖感測所須具備的技術包括橢圓鏡術(ellipsometry),內部反射(internal reflectometry),漸逝波(evnescent wave),光散射(light scattering)與折射指數量測(refractive index mesurement),表面薄膜共振(surface plasma resonance),螢光偏極化(fluorescence polarization)等。

近年來,在光纖生物感測器發展上有兩項極為熱門的關鍵技術,分別為漸逝波(簡稱EW)與表面薄膜共振(簡稱SPR)技術。瑞典商Pharmacia公司於1991年推出的BIAcore與BIAlite生物感測產品,即是基於成功地掌握SPR關鍵技術所致。茲將此兩項技術簡述如下:

      1.漸逝波技術(Evanescent wave technology)

漸逝波現象是半隨著全內反射而產生的。在全內反射發生的介面,理論上雖然入射光線會全部向內反射並在光纖內傳導,但是其能量並非全部侷限在n1的介質中,此時,一種稱為漸逝波(evanescent wave)的電磁場以垂直於光纖軸心方向,向n2介質穿透約少一個波長的距離。根據Maxwells equation,此電磁場以正弦立波存在於n1介質中,而其震幅在n2介質中並不會變成零,而是以指數衰減方式逐漸減少。方程式1中,E是離此交界面的任一距離的電磁場的振幅,E0是在表面的最大振幅,dp為振幅衰減至原來的1/e的穿透深度,而Z為距交界面的距離。穿透深度dp可從方程式2求得,其中 為入射光的波長。若入射光的波長為500nm,則穿透深度大約為100nm,而電磁場強度大約為界面時強度的36%。

水溶液的折射率約等於1.33,如果用氫氟酸侵蝕掉光纖的外覆層(cladding),再將光纖核心放入水溶液中,則全反射仍然產生,並在液相環境中產生漸逝波。此時,如果在此介面的漸逝波能量涵蓋範圍內存在有螢光物質,則此螢光物質會被激發而產生波長較激發光長的螢光,此螢光亦會進入光纖中,並且同樣地以全內反射的方式在同一條光纖中傳導,此時可在光纖另一端安置光偵測器來達到感測目的。因此,我們可以在光纖表面固定抗原或抗體,利用此一漸逝波現象結合螢光免疫反應,發展為光纖免疫生物感測器。

      2.表面薄膜共振技術(Surface Plasma Resonance Technology)

表面薄膜共振(SPR)係一種光學現象。當光束於玻璃介質內傳導時,於光路徑上遇金屬薄層界面交接處產生內全反射(total internal reflection)時所伴隨的光學物理現象。由於光束的電子振盪與金屬薄層內金屬原子產生共振作用時,在特定的反射角範圍內會引起反射強度的急劇變化,此一反射角(angle of reflection)又稱為共振角(resonance angle),如圖五(a)所示。共振角隨著非照射面金屬薄層鄰近介質的折射指數(refractive index)之不同而變化。因此,雖然入射光束在傳導路徑上碰到金屬薄層界面時會產生全反射,但事實上,有部份光能量會穿透界面進入到非照射端的介質中,穿透距離大約為一個波長的距離左右,此一現象如同前節所述的漸逝波一樣。當環境介質因組成、濃度或成份改變時所導致折射係數的變化,則會藉由漸逝波的光動能反應到共振角的變化上。與金屬面鄰接的介質部份之有效回應距離約距金屬表面300nm左右,由於折射指示值隨該有效距離內之溶液的濃度而改變,因此SPR技術可以用來定量靠近感測電極表面之待測物濃度,而不需預先做任何標識(labelling)。

圖五(b)所示則為SPR技術應用在即時式(real-time mode)免疫感測的反應強度對時間作圖。縱軸單位為SPR回應訊號,為量測共振角(resonance angle)的變化所獲之任意單位(arbitrary units)稱之為共振單位(resonance unit, RU),1000RU的變化相當於1ng/mm2的表面蛋白質濃度變化;橫軸為時間,以秒為單位。當測試開始時(t=0),感測電極表面只有抗體存在,RU維持在基礎穩定平衡狀態;當抗體-抗原產生反應時(t=150),可以明顯看出RU急劇上升,直到另一較高穩定平衡狀態;繼續進行與第二抗體(secondary Ab)反應(t=300)時,亦可看出RU再度急劇攀升至另一高階穩態平衡;最後以解離劑宜除抗體表面的結合物(t=350),可以看出RU又回到起始值之穩定平衡狀態,完成一個循環得測試。由於RU值與電極表面的物質濃度成一相關比例,因此SPR技術可以用來進行定量分析。另外,由於是即時式偵測,故可以由反應強度-時間圖直接獲得親和動力學(associate kinetics)與解離動力學(dissociate kinetics)方面的資訊。

  • (四)壓電晶體生物感測器(Piezoelectric quartz crystal biosensor)

壓電晶體在近年來才被引用到生物感測器的轉換器使用。最早的應用微作微質量天平使用(QCM, quartz crystal microbalance)。早期的壓電晶體感測器,用在測定空氣汙染物質測定,然使用在電極表面具有感測功能的包覆材料大多為非生物性物質(abiotics)。Guilbault(1983)首先發表使用甲醛去氫酵素(formaldehyde dehydrogenase)與輔因子固定化在晶體電極上用來測定空氣中的甲醛成份,才開始引發生化界的重視。然而截至目前為止,有關壓電晶體生物感測器的研究尚在起步階段而已。

典型的壓電石英晶體如圖六(a)所示,其石英版通常為兩片金屬電極(例如金、銀、鋁和鎳等)如同三明治般地夾在中間。電極的作用為沿晶片表面垂直方向導入一振盪電場(oscillating electric field)。此一振盪電場迫使晶體內部結晶格子產生類似立波(standing wave)的機械振盪行為。假使石英板的厚度一定,此種機械性振盪可以以一定額的頻率表現出來。而諧振頻率(resonant frequency)很容易藉著導入一適當的振盪電路來量測出。此種由於機械與電子兩種振盪交聯所產生的諧振頻率決定於下列數頓因素,其間某些因素在正常情況下均為固定值包括石英晶片的物理性質如厚度、密度如剪力係數,某些情況下,下列因素亦保持在一固定值,包括與氣體或液體接觸時晶體表面之密度、黏度及橫跟晶片兩面間之壓力差與溫度等。而改變晶體頻率最大的因素為電極的質量與外加附著在電極上的薄膜之質量變化。

Sauerbrey氏首先導出積層在石英晶體之金屬膜質量與頻率變化的關系式,用來描述大部分場合下,尤其在氣相狀態下壓電晶體之質量變化與頻率應答的關係。

F=-2.3×106F2 M/A

其中 F表示因質量負載所致的頻率變化(Hz);f為石英晶體的振盪頻率; M為電極上外覆的質量負載(g);A則表示金屬電極的面積。由上式關係可以得知,隨著質量負載( M)的增加,頻率衷減值( F)愈大。計算其頻率應答範圍可以得知偵測極限值可以達到ppt(10-12g)位準。

壓電石英晶體不僅可以在氣相環境下產生振盪頻率,同時當與液體接觸時,亦會隨溶液之密度、黏度性質改變而產生頻率變化。Kanazawa等人首先導出下列關係式:

F=-2f03/2sφsqφq)1/2

其中μs為溶液的黏度(viscosity); φs為溶液的密度(density); μq與φq則分別代表石英晶體之黏度與密度。

由於上式中,f0、μq、φq等項均為常數,因此可知於液相狀態下壓電晶體之頻率衰減值主要係受溶液的黏度與密度變化所影響。

由此,只要在壓電晶體電極面上固定化上一層生物分子辨認薄膜,即可用來偵測相對應的化合物;如抗體-抗原,酵素-基質,激素-受體等。由於壓電晶體偵測靈敏度可達10-12g位準,因此可適用於一般生物分子階層的感測。

壓電晶體生物感測器截至目前為止,已發展出數種在氣相環境下測定揮發成分的感測探針,如甲醛、有机磷化合物、巴拉松如古柯鹼等。吳、王等人利用棤仿動物嗅覺辨認的原理,已成功開發出多陣列壓電晶體嗅覺生物感測器-人工鼻,此一具「人工嗅覺」功能的生物感測系統可應用於惡臭污染偵測、酒類、食口及化菻~工業上使用。未來將更朝醫療「呼氣」診斷的目標邁進,期能藉由呼氣中呈現的特定「氣味」來瞭解疾病的線索,以作為診斷的參考依據之一。另外,應用壓電晶體結合特定生物辨認分子的感測器有:病原菌微生物量的測定,凝血素濃度測定,免疫球蛋白測定,生長激素測定,基因探針生物感測器愛滋病與安非他命感測器等。財團法人生物技術開發中心更在此方面積極投入,目前已完成自動化多陣列壓電晶體親如性生物感測系統的開發。該系統主要由(1)感測器硬體,(2)資料擷取控制與分析部分,(3)卡匣式壓電晶體生物感測探針等三部分所構成,系統原理為將生物識別分子與壓電晶體之金電極結合,利用壓電晶體之共振頻率改變與微質量/黏度改變相關之平衕特性,來偵測生物識別分與待測對應物間之即時式交互反應,以達到定性或定量分析的目的。

 

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